從甲殼動物免疫系統(tǒng)特點談對克氏原螯蝦“五月瘟”的防控對策

　　

　　文|華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 陳昌福、武漢科研時代生物技術(shù)有限公司 周鑫軍、浙江省舟山市海洋與漁業(yè)局 油九菊 夏楓峰

　　

　　近幾年，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）的人工養(yǎng)殖業(yè)在我國發(fā)展異常迅速，尤其是華中地區(qū)的稻田養(yǎng)蝦模式，被各級政府作為一項“助力農(nóng)民增收”的惠民技術(shù)措施，正在我國農(nóng)村更大的范圍內(nèi)作為克氏原螯蝦養(yǎng)殖技術(shù)進行推廣與示范。

　　

　　在我國的華中地區(qū)，進入五月份后就是克氏原螯蝦的收獲季節(jié)，因為即使當(dāng)年繁殖出來的克氏原螯蝦蝦苗，此時也已經(jīng)達到可以上市銷售的規(guī)格了。然而，特別是位于湖北地區(qū)的克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)者，一旦進入五月份，就開始受到克氏原螯蝦所謂“五月瘟”的困擾。大量已經(jīng)基本上達到上市規(guī)格的克氏原螯蝦，可能出現(xiàn)尚不明原因的病害而出現(xiàn)大量死亡（圖1），所謂的“五月瘟”每年均可能給克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)者造成較大的經(jīng)濟損失。

　　

　　

　　關(guān)于誘發(fā)克氏原螯蝦出現(xiàn)“五月瘟”的原因，已經(jīng)有人發(fā)布了相關(guān)文章表達了各種不同的意見。如有人認(rèn)為氏原螯蝦出現(xiàn)“五月瘟”是由于感染了某種病毒、細(xì)菌的緣故；有人認(rèn)為是由于華中地區(qū)進入五月份后，氣溫和水溫的變化幅度均很大，致使克氏原螯蝦遭受到了溫度大幅度變化的應(yīng)激性刺激的緣故；也有人認(rèn)為是因為養(yǎng)殖水環(huán)境惡化造成的對養(yǎng)殖克氏原螯蝦的應(yīng)激性刺激所致；還有人認(rèn)為是人們投喂的餌料中營養(yǎng)元素，不能滿足克氏原螯蝦生長和繁殖的基本需求，可能是餌料中缺乏了某種蛋白質(zhì)、維生素、脂肪和礦物質(zhì)等。

　　

　　雖然人們常說，任何疾病的發(fā)生都是有致病原因的，沒有原因的疾病是不存在的。但是，引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動物某種疾病的原因也可能是非常復(fù)雜的，最終闡明克氏原螯蝦“五月瘟”的發(fā)病原因，可能尚需要一些時間。不過，無論是什么原因?qū)е驴耸显�螯蝦出現(xiàn)各種疾病與死亡，發(fā)生疾病的克氏原螯蝦的免疫系統(tǒng)受到了抑制或者破壞，則可能是一定的。因此，關(guān)注和維護克氏原螯蝦自身的免疫防御系統(tǒng)，并且在飼料中添加一些具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)克氏原螯蝦自身的免疫機能與水平，可能也是對克氏原螯蝦“五月瘟”最好的防控途徑與措施。

　　

　　

　　1.蝦類（甲殼動物）的免疫系統(tǒng)及其特點

　　

　　蝦類屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、游泳亞目（Natantia）。蝦類的免疫系統(tǒng)由免疫細(xì)胞、免疫器官和體液免疫因子所組成。

　　

　　

　　蝦類免疫細(xì)胞主要包括血細(xì)胞和固著性細(xì)胞等兩大類。

　　

　　固著性細(xì)胞主要是包括分布在鰓和觸角腺的足細(xì)胞（podocyte）、附著在心臟和肌纖維上的吞噬性貯藏細(xì)胞（phagocytic reserve cell）以及連接肝胰腺細(xì)動脈的洞樣血管內(nèi)的固著性吞噬細(xì)胞。固著性細(xì)胞已經(jīng)被證明具有識別、吞噬和清除外源蛋白類物質(zhì)與病毒的能力。

　　

　　蝦類的血細(xì)胞又稱血淋巴細(xì)胞。由于蝦類種類繁多和形態(tài)多樣以及血細(xì)胞離體后易發(fā)生變形等諸多因素，導(dǎo)致蝦類血細(xì)胞的分類學(xué)研究進展比較緩慢。近年來，人們應(yīng)用電鏡技術(shù)、組織化學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)等對蝦類血細(xì)胞進行了研究，獲得了一些研究進展。但是，至今仍無統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)。目前通常根據(jù)血細(xì)胞中有無顆粒及其大小而將其分為透明細(xì)胞（hyaline cell）、小顆粒細(xì)胞（semigranular cell）和顆粒細(xì)胞（granular cell）等三種類型。不同類型的血細(xì)胞所起的作用有所不同，其中吞噬作用是血細(xì)胞最重要的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

　　

　　這3種血細(xì)胞在蝦類免疫防御反應(yīng)中表現(xiàn)出相互協(xié)同作用，小顆粒細(xì)胞對異物敏感，在異物刺激下發(fā)生胞吐作用（exocytosis），釋放酚氧化酶系統(tǒng)組分，活化的酚氧化酶系統(tǒng)組分一方面作用透明細(xì)胞，誘導(dǎo)其發(fā)揮吞噬作用，另一方面又可刺激顆粒細(xì)胞釋放更多的酚氧化酶系統(tǒng)組分，參與體液免疫應(yīng)答。

　　

　　有關(guān)蝦類血細(xì)胞的演化途徑，目前有三種觀點：一些學(xué)者認(rèn)為各類血細(xì)胞均是由單一的一種干細(xì)胞分化而來（Bacuchau，1981）；有些學(xué)者認(rèn)為3種血細(xì)胞是由一種干細(xì)胞在造血組織中分別分化而來（Ghiretti-Magaldi，1997）；另外一些學(xué)者的觀點是干細(xì)胞分化出兩種細(xì)胞系列，如顆粒細(xì)胞系列和透明細(xì)胞系列，小顆粒細(xì)胞是顆粒細(xì)胞的未成熟階段（Martin，1993），或者顆粒細(xì)胞系列和小顆粒細(xì)胞系列，透明細(xì)胞是這兩種細(xì)胞的未成熟階段（Van de Braak，2002）。

　　

　　

　　免疫器官是指一些與免疫相關(guān)的器官，蝦類免疫器官包括鰓（gill）、血竇（haemal sinus）和淋巴器官（lymphoid organ）。

　　

　　首先，當(dāng)異物進入機蝦類體內(nèi)后，不僅可通過血細(xì)胞的吞噬作用加以清除，還可隨血淋巴進入鰓中存儲和清除。異物被濾入鰓絲中，儲存在鰓血竇和鰓絲末端膨大結(jié)構(gòu)中，鰓絲腔中的血細(xì)胞可游走至此囊狀結(jié)構(gòu)中進行吞噬清除，或在蛻皮時一起蛻掉。

　　

　　其次，蝦類的血竇分布于機體各處，既是血淋巴交換的場所，也是病原微生物經(jīng)常能入侵的部位。血竇濾過異物后，血細(xì)胞數(shù)量明顯增加，吞噬作用明顯增強，并且吞噬體的降解產(chǎn)物和毒物可引起類炎癥反應(yīng)。

　　

　　其三，蝦類的淋巴器官位于蝦體胃的腹側(cè)，左右各1葉，長約5~7mm，外包被結(jié)締組織膜，內(nèi)部由淋巴小管（動脈管）和球狀體組成。對淋巴小管的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，它是由一類形態(tài)相似具有高吞噬活性的細(xì)胞組成，其吞噬活性甚至比血細(xì)胞還強。目前認(rèn)為球狀體是由退化的血細(xì)胞在血竇中聚集形成的細(xì)胞團，具有酚氧化酶和過氧化物酶活性。球狀體的形成是蝦類對病原微生物感染做出的一種常見反應(yīng)，根據(jù)球狀體的形態(tài)學(xué)變化將其形成，可分為無囊狀纖維細(xì)胞包繞的腫瘤樣階段、完全被纖維包繞的球形階段和具有泡囊細(xì)胞的退化階段等三個階段。

　　

　　蝦類血淋巴中含有天然形成的或誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種免疫因子，如模式識別蛋白、凝集素、酚氧化酶原激活系統(tǒng)、溶血素、抗菌肽、熱休克蛋白等。這些免疫因子參與蝦類的體液免疫過程。

　　

　　從上述介紹內(nèi)容可見，蝦類的免疫系統(tǒng)雖然沒有進化到如同高等脊椎動物的免疫系統(tǒng)一樣精密，但是，已經(jīng)具備了對外界異物等，在細(xì)胞及體液水平上產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)，也就是說水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者通過調(diào)節(jié)克氏原螯蝦免疫系統(tǒng)的機能，是可以達到調(diào)節(jié)其免疫系統(tǒng)機能、增強其機體抗病能力的目的的。

　　

　　

　　人們在預(yù)防蝦類的傳染性疾病時，雖然不能給予蝦類一些研制出來的死菌或者活菌作為“疫苗”，象用于脊椎動物的疫苗一樣，能誘導(dǎo)蝦類產(chǎn)生出特異性的抗體來。但是，這些物質(zhì)進入蝦類體內(nèi)后，也還是可以對蝦類的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激的，將具有對蝦類可產(chǎn)生免疫誘導(dǎo)作用的物質(zhì)稱為“疫苗”也許不是很合適。所以，有人認(rèn)為將這種“疫苗”，稱為免疫調(diào)節(jié)劑（Immunomodulator）可能更恰當(dāng)一些。

　　

　　預(yù)防蝦類細(xì)菌性傳染病的免疫調(diào)節(jié)劑，最早是為了預(yù)防美洲螯蝦（Homarus americanus）的高夫敗血癥（Gaffkemia）而研制的。試驗結(jié)果表明用高夫敗血癥致病菌淺綠氣球菌（Aerococcus viridans）制備的滅活菌苗注射或者浸泡美洲龍蝦后，試驗美洲龍蝦都能對高夫敗血癥產(chǎn)生免疫力。用這種滅活菌苗作為免疫調(diào)節(jié)劑在野外進行的試驗結(jié)果表明，免疫接種區(qū)蝦的存活率顯著高于對照區(qū)，說明這種免疫調(diào)節(jié)劑對美洲龍蝦的高夫敗血癥具有很好的免疫預(yù)防效果。

　　

　　為了預(yù)防澳洲螯蝦（Cherax albidus）由病原性假單胞菌（Pseudomonas sp.）引起的傳染病，采用鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）制備的免疫調(diào)節(jié)劑投喂，取得了良好的預(yù)防效果，而且從這種菌體中提取的脂多糖（LPS）也顯示出對這種傳染性疾病具有良好的預(yù)防效果。用螯蝦的血細(xì)胞對經(jīng)血清調(diào)理后的綿羊細(xì)胞進行吞噬活性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用投與疫苗后的螯蝦血清調(diào)理的血細(xì)胞，其吞噬活性明顯地高于用未接種疫苗的螯蝦血清處理組，因此，認(rèn)為血清的調(diào)理作用與預(yù)防Pseudomonas sp菌株引起的傳染病有關(guān)。

　　

　　Lewis等將副溶血性弧菌（Vibrio alginolyticus）加熱滅活后，采用浸泡法接種白對蝦（Penaeus setiferus），６周后進行的攻毒試驗的結(jié)果表明，與對照組相比，接種疫苗的受免對蝦對活菌攻擊產(chǎn)生了很強的保護力。Itami等將從患弧菌病的日本對蝦（Penaeus japonicus）中分離的病原弧菌（Vibrio sp PJ）用福爾馬林滅活后，采用注射、浸泡和噴霧法接種日本對蝦，30 d后進行活菌攻毒試驗，結(jié)果表明3種接種方法，都能使受免對蝦產(chǎn)生對弧菌病的免疫預(yù)防效果。他們還對浸泡接種法進行了深入地研究，證明了將福爾馬林滅活的培養(yǎng)菌液稀釋到1.0％的濃度，對日本對蝦浸泡1~5 h的接種方式，可以獲得最好的免疫預(yù)防效果。

　　

　　關(guān)于口服疫苗的免疫效果，有人將V.sp PJ死菌包被在微囊中后投喂斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）的蚤狀期幼蝦，當(dāng)蝦成長到糠蝦幼體時期后統(tǒng)計其生存率和變態(tài)數(shù)量，結(jié)果表明無論是生存率還是變態(tài)數(shù)量都是免疫組高于對照組。這種含有弧菌死菌的微囊飼料究竟是增強了蝦體的免疫防御能力，還是成為了飼料中的某一營養(yǎng)素的來源，尚值得進一步深入研究。對于接種滅活菌體而刺激對蝦免疫防御機能的機理，Itami等用波爾登氏環(huán)室法（Noyden's chamber）檢測了受免對蝦血細(xì)胞活化因子，證明經(jīng)過免疫接種后的日本對蝦血清中，存在能促進血細(xì)胞產(chǎn)生活化因子的物質(zhì)。Song等將創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）滅活后經(jīng)口和浸泡接種斑節(jié)對蝦，發(fā)現(xiàn)對受免對蝦的生長具有促進作用。但是，由于研究者未能在免疫和對照蝦的血液中觀察到血藍(lán)蛋白量和銅離子含量的差異，所以認(rèn)為因接種滅活菌體而促進了蝦體新陳代謝的證據(jù)不足。因此，推測這種促生長效果是由于接種滅活菌體活化了對蝦機體的防御機能，使對蝦免除了細(xì)菌感染影響的緣故。然而，由于還沒有通過抗感染防治試驗和防御因子活性的比較試驗獲得防止細(xì)菌感染的直接證據(jù)，因此，對于這一點今后還應(yīng)該進一步的研究。不過，口服免疫調(diào)節(jié)劑不僅對于蝦類的成長和存活率，而且對其變態(tài)也產(chǎn)生了影響，這是很有實踐意義的。

　　

　　陳昌福等利用安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的免疫多糖（酵母細(xì)胞壁）注射到凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）體內(nèi)后，檢測了供試蝦血清、肌肉和肝胰腺提取液中的酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）和過氧化物酶（POD）的活性。研究結(jié)果表明，凡納濱對蝦經(jīng)注射免疫多糖（酵母細(xì)胞壁）刺激后，肝胰腺中的ACP和ALP活性明顯增加，在注射后72 h，ACP活性由對照組的3.13 U·100 mL-1提高到9.34 U·100 mL-1，ALP活性由3.83 U·100 mL-1提高到12.8 U·100 mL-1，而在血清和肌肉中ACP和ALP的活性沒有明顯變化。

　　

　　甲殼動物機體防御機能的活化，并不象脊椎動物那樣必須要求用致病菌作為免疫原，這就意味著活化甲殼動物防御機能的物質(zhì)可以在更廣的范圍內(nèi)尋找。事實上也已經(jīng)有人將用于人類癌癥治療的免疫療法，以及用于魚類疾病預(yù)防的免疫調(diào)節(jié)劑用到了蝦病預(yù)防試驗中。Sung等采用從酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）細(xì)胞壁中提取的β-1，3-萄聚糖的懸浮液浸泡斑節(jié)對蝦，浸泡處理后的18 d內(nèi)對V.vulnificus顯示出抗感染力的同時，受免蝦體內(nèi)的PO的活性也有明顯上升。Itami等采用從裂殖菌（Schizophyllan commune）中提取的β-1，3-萄聚糖投喂日本對蝦后，不僅受免蝦血細(xì)胞吞噬活性明顯增強，同時用V.dp PJ進行的人工攻毒試驗，也證實了受免蝦的抵抗力顯著增強，在供試蝦血清中出現(xiàn)了對正常蝦G細(xì)胞的吞噬活性有促進作用的物質(zhì)。從嗜熱雙岐桿菌（Bifidobaclerium thermophilum）中提取的肽聚糖投喂日本對蝦后，對V.sp PJ的抗感染防御能力和血細(xì)胞的吞噬活性都明顯地增強。從上述一些研究結(jié)果中可以看出，免疫調(diào)節(jié)劑可以增強蝦類的抗感染能力，尤其是口服的方式也可以誘導(dǎo)供試蝦產(chǎn)生相應(yīng)的免疫防御能力，這對于野外養(yǎng)蝦池中大量飼養(yǎng)蝦的疾病預(yù)防具有實用性。

　　

　　3.如何調(diào)節(jié)克氏原螯蝦的免疫系統(tǒng)實現(xiàn)對“五月瘟”的防控

　　對于引起克氏原螯蝦“五月瘟”的原因，雖然尚不十分清楚。不過，不少克氏原螯蝦養(yǎng)殖者的用藥經(jīng)驗已經(jīng)證明，當(dāng)克氏原螯蝦發(fā)生“五月瘟”以后，為了治療這種疾病而使用某些藥物，期望控制這種瘟病是幾乎不可能的。無數(shù)依靠藥物治療“五月瘟”的實例均已經(jīng)殘酷地證明，藥物使用的越多、調(diào)水操作越是頻繁，患病克氏原螯蝦往往死亡的速度越快、而且死亡的越是徹底。也就是說，在克氏原螯蝦“五月瘟”發(fā)生以后，期望采用某種藥物達到有效治療這種疾病的目的，至少是比較困難的。因此，克氏原螯蝦的養(yǎng)殖業(yè)者通過穩(wěn)定養(yǎng)殖環(huán)境，避免對克氏原螯蝦造成各種脅迫，依靠穩(wěn)定其機體的免疫系統(tǒng)和調(diào)節(jié)機體的免疫機能，可能才是最好的防控克氏原螯蝦“五月瘟”的有效措施與途徑。

　　

　　克氏原螯蝦的養(yǎng)殖業(yè)者實現(xiàn)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)克氏原螯蝦的免疫機能，主要應(yīng)該做好以下幾方面的工作。

　　

　　3.1學(xué)習(xí)和掌握克氏原螯蝦的生態(tài)習(xí)性，為克氏原螯蝦營造適宜生存環(huán)境

　　

　　與其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動物相比，克氏原螯蝦具有相對特殊的生態(tài)習(xí)性，從事克氏原螯蝦的養(yǎng)殖的人員必須不斷學(xué)習(xí)相關(guān)的科學(xué)知識，尤其是需要充分了解克氏原螯蝦的生態(tài)、生活習(xí)性，為其營造適宜的生存和生活環(huán)境，減少和避免因為各種不良的養(yǎng)殖環(huán)境因子，對克氏原螯蝦造成脅迫而抑制其免疫系統(tǒng)的正常機能。

　　

　　3.2選擇優(yōu)質(zhì)餌料，充分滿足克氏原螯蝦機體的營養(yǎng)需求

　　

　　已經(jīng)有較多的研究結(jié)果證明，沒有任何一種化學(xué)藥物能夠代替動物的免疫系統(tǒng)而發(fā)揮其相同的功能。動物機體的免疫系統(tǒng)主要依靠從具有比較全面營養(yǎng)物質(zhì)的餌料中獲得有益元素而得以“加強”。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者應(yīng)該為克氏原螯蝦選擇優(yōu)質(zhì)餌料，滿足處于生長在各階段的克氏原螯蝦的營養(yǎng)需求，這是有助于穩(wěn)定和調(diào)節(jié)克氏原螯蝦的免疫系統(tǒng)的。

　　

　　3.3監(jiān)測致病生物的藥物敏感性，避免盲目用藥導(dǎo)致對克氏原螯蝦的脅迫

　　

　　對克氏原螯蝦的致病生物進行藥物耐藥性變化狀況的常年監(jiān)測，一旦需要采用藥物協(xié)助治療某種疾病時，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者可以根據(jù)致病生物耐藥性監(jiān)測結(jié)果，正確地選擇藥物并且精準(zhǔn)地使用藥物，避免因為盲目地使用各種沒有治療效果的藥物，而導(dǎo)致對克氏原螯蝦造成的藥物脅迫，影響到克氏原螯蝦免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常的功能。

　　

　　3.4科學(xué)選擇和使用免疫調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定和調(diào)節(jié)克氏原螯蝦的免疫系統(tǒng)與免疫水平

　　

　　已經(jīng)有大量研究與應(yīng)用結(jié)果證明，如安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的酵母多糖類，北京英惠爾生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的酵母培養(yǎng)物，以及北京生泰爾科技股份有限公司生產(chǎn)的黃芪多糖等，對克氏原螯蝦的免疫系統(tǒng)具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。其作用機理主要是在于這些物質(zhì)對克氏原螯蝦使用后，能調(diào)節(jié)其消化道內(nèi)的微生物結(jié)構(gòu)，保護其消化道微絨毛不受損傷，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生非特異性免疫因子和吞噬細(xì)胞的吞噬活性。此外，還有促進攝食與生長的功能。

　　

　　在使用免疫調(diào)節(jié)劑時需要注意的是，每一種免疫調(diào)節(jié)劑的有效劑量都存在使用上限和下限，對克氏原螯蝦采用間隔一定時間定期、定點、適量投喂的程序，較長期連續(xù)投投喂的效果好，而且只有在投喂量和方法正確的前提下，免疫調(diào)節(jié)劑才能幫助克氏原螯蝦的免疫機能正常地發(fā)揮作用。

　　

　　關(guān)于免疫調(diào)節(jié)劑投喂的時機，如果能做到在克氏原螯蝦“五月瘟”流行季節(jié)來臨之前，連續(xù)投喂一段時間，將克氏原螯蝦的免疫機能調(diào)節(jié)到正常水平，就能實現(xiàn)最有效的防護作用。而在各種傳染性疾病的流行高峰時期來臨之前，可以采用連續(xù)投喂的方式，而在一般養(yǎng)殖時期則可以采用連續(xù)投喂2周，間隔2周后再進行第2個投喂周期的方式進行。