原創(chuàng)技術(shù)貼之四-自己擴(kuò)培發(fā)酵活菌的誤區(qū)

horsegreenhill

自己擴(kuò)培發(fā)酵活菌的誤區(qū)

中國海洋大學(xué) 水產(chǎn)微生物

馬青山博士

       受到病害、臺風(fēng)及價格行情等因素的影響，今年水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)有些慘淡。養(yǎng)殖戶通過多種方式控制成本，而自行擴(kuò)培發(fā)酵活菌就是其中之一。不少養(yǎng)殖戶自己搗鼓發(fā)酵，也有挺多這種形式的套裝產(chǎn)品，但我發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)培的過程中存在挺多的誤區(qū)和問題。下面就同大家進(jìn)行分享：

1、  關(guān)于擴(kuò)培的菌種

       所使用微生物種類：

       我在下面轉(zhuǎn)市場發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在好像什么菌種養(yǎng)殖戶都能擴(kuò)培、什么菌種的產(chǎn)品擴(kuò)培套餐都有，EM、芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、光合細(xì)菌都全乎了。但我只推薦大家自己擴(kuò)培乳酸菌、光合細(xì)菌，為什么呢？首先大家要注意，自己擴(kuò)培最重要的是不能染雜菌！而乳酸菌兼性厭氧，并且擴(kuò)培好的pH在4-5左右，一般雜菌難以生長；而光合細(xì)菌厭氧擴(kuò)培，且培養(yǎng)基組分相對缺乏營養(yǎng)，也不易染雜菌。

      下圖是養(yǎng)殖戶自己擴(kuò)培的乳酸菌，密封發(fā)酵，擴(kuò)培20h，擴(kuò)培出來發(fā)酵液的活菌數(shù)我也跟著測了，有10⁸cfu/ml，基本沒有雜菌。所以說，厭氧密封的條件下，擴(kuò)培還是比較容易成功的。

file:///C:/Users/DBN-PR~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image002.jpg

       不過，像EM、芽孢桿菌等，它們是需氧菌，也就是說你擴(kuò)培的時候要敞著蓋，某些產(chǎn)品說明書里還讓大家通氣、攪拌，這不就相當(dāng)于接種雜菌么？另外，這兩種菌擴(kuò)培的pH在7左右，一般雜菌都能生長，整不好就擴(kuò)培出有致病性的微生物，所以不建議自己擴(kuò)培，不過大家倒是可以在使用前加點紅糖，活化個2-4個小時潑灑，既不染菌，又增強了芽孢桿菌的活力。

       下圖是養(yǎng)殖戶自己擴(kuò)培的EM菌，大家可以看到其表面漂浮一層厚厚的白膜，這層白膜主要由需氧菌組成，理想的情況下是一些枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，這樣用起來倒是沒什么壞處；但也不排除可能是某些致病需氧菌，那就比較麻煩了。所以自己擴(kuò)培需氧菌，風(fēng)險還是比較高的。

file:///C:/Users/DBN-PR~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image004.jpg

菌種可用代數(shù)：

       除光合細(xì)菌外，其他自己擴(kuò)培的活菌不建議留種，原因有二：1、易染雜菌；2、菌種活力欠佳。而光合細(xì)菌菌種擴(kuò)培最好控制在4代以內(nèi)，4代以上，菌種活力明顯下降。

2、  關(guān)于擴(kuò)培的培養(yǎng)基

       擴(kuò)培的培養(yǎng)基一般有兩個來源，一個是養(yǎng)殖戶自己配制的，另一個是產(chǎn)品套裝里帶的，但不管是哪一種，都離不開一股子糖蜜味，為啥？1、糖蜜便宜；2、糖蜜提供碳源；3、擴(kuò)培的發(fā)酵液一股香甜的糖蜜味，養(yǎng)殖戶感覺味道好。但真正的擴(kuò)培培養(yǎng)基是不加糖蜜的，大家可以看看下面的培養(yǎng)基：

實驗室擴(kuò)培芽孢桿菌、EM菌：

       胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，配制1L培養(yǎng)基；

實驗室擴(kuò)培乳酸菌：

       酪蛋白胨 10g、 酵母提取液 5g、葡萄糖 5g、乙酸鈉 5g，配制1L培養(yǎng)基；

       這種培養(yǎng)基可以迅速讓微生物擴(kuò)培生長，且營養(yǎng)均衡，能夠達(dá)到較高的活菌數(shù)，但相對來講會比糖蜜為主的培養(yǎng)基貴，不過，若大家直接去淘寶買大包裝，也能便宜不少。

3、  關(guān)于擴(kuò)培的方法

   之前已經(jīng)提到，微生物擴(kuò)培發(fā)酵最需要注意的地方就是要嚴(yán)格控制雜菌的污染，而這里提到的擴(kuò)培方法也主要是這方面的一些注意事項。

（1）      擴(kuò)培活菌所用的桶、盆等容器最好消消毒，所用的水最好加熱滅下菌。

（2）      不同微生物有自己適合生長的溫度，一般而言，擴(kuò)培建議在25攝氏度左右，比較適合現(xiàn)在應(yīng)用較多的乳酸菌、芽孢桿菌等的生長。

（3）      為了防止污染，乳酸菌、光合細(xì)菌密封發(fā)酵，發(fā)酵期間不要攪拌；EM、芽孢桿菌等需氧菌發(fā)酵過程需要攪拌的，建議每桶配一根棍子，防止交叉污染。

（4）      每次取用后要嚴(yán)格密封放在陰涼遮陽處存放，需要長時間保存最好分裝在小容器中。

4、  擴(kuò)培終點的判斷

       不同的菌種，擴(kuò)培終點的判斷方法有所不同。一般而言，養(yǎng)殖戶主要通過聞味道對發(fā)酵終點進(jìn)行判斷，除某些光合細(xì)菌外，擴(kuò)培出來的發(fā)酵液味道以酸香味、酵香味為主，出現(xiàn)餿味、腐敗味道，可能污染雜菌，建議不要使用。

       除了聞味道，養(yǎng)殖戶也可以自己測測pH值，像乳酸菌發(fā)酵終點pH值一般為4-5左右，芽孢桿菌、EM、光合細(xì)菌pH值一般為7-8左右。

       最后，有條件的養(yǎng)殖戶最好能用顯微鏡鏡檢一下，40物鏡×10目鏡即可清晰看到乳酸菌、芽孢桿菌等微生物，取發(fā)酵液自己看看，到底有多少微生物，是球的，還是桿的，等等�？傊�，有了顯微鏡可以更好地判斷發(fā)酵好壞及發(fā)酵終點，具體方法就不在這里展開了，有需要的可以直接聯(lián)系我詳聊（QQ：416063411）。

注：此文屬個人原創(chuàng)，謝絕轉(zhuǎn)載！

漁歌子

感謝馬博士的分享！

濤家強

感謝樓主的分享！

horsegreenhill

不客氣，有問題可以直接交流！

jinlimin1

請教400倍顯微鏡怎么看乳酸菌、芽孢桿菌等微生物？

蟹將

的確是博士級別的 但是這個培養(yǎng)配方不適合養(yǎng)殖戶，而且自己培養(yǎng)EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌數(shù)量級達(dá)到十億。

蟹將

這篇文章可能有一些不妥的地方 ，提提意見

1. 乳酸菌發(fā)酵時間才20h,就來進(jìn)行質(zhì)量評價，不科學(xué)，起碼發(fā)酵96小時以上再評價比較妥當(dāng)

2. 實驗室擴(kuò)培芽孢桿菌、EM菌：
  胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，配制1L培養(yǎng)基； 這個配方是經(jīng)典的培養(yǎng)大腸桿菌的配方，但是拿來發(fā)酵培養(yǎng)芽孢桿菌，EM菌，是不是有點太兒戲了，大量的碳源在哪兒？

3、第二個配方里面用到了葡萄糖，以前養(yǎng)殖戶都喜歡往水里潑葡萄糖，現(xiàn)在基本很少了，為什么？很多人認(rèn)為是弧菌比較喜歡吃單糖，潑到水里培養(yǎng)弧菌了。現(xiàn)在養(yǎng)殖戶培養(yǎng)乳酸菌、EM菌愛用紅糖，跑塘口多的話，這個不得不提。

4. 現(xiàn)在大部分EM菌還是采取厭氧發(fā)酵的，不需要攪拌需要密封，最終成品pH 在3-3.5，如果是7-8看誰敢用。（另外現(xiàn)在水產(chǎn)上售賣的EM菌，其實是大多數(shù)是以乳原來酸菌、酵母菌、等一些菌復(fù)配出來的，原來傳統(tǒng)說法80多種菌的EM菌只是一個傳說）

5。顯微鏡下，除非酵母菌、糞鏈球菌之類的特殊形態(tài)菌，在400倍下想?yún)^(qū)分是乳酸菌還是什么其他雜菌，還是洗洗睡吧，但是如果有顯微鏡，看見很多菌，而且pH也很低，那基本上發(fā)酵是成功了。所以測量pH是發(fā)酵乳酸菌 EM菌的最簡單方法，低于3.5即可

只是探討，水產(chǎn)行業(yè)需要多種聲音，我說的也不一定是對的，只是因為實踐過，所以說說意見。

vanadis

自己擴(kuò)培益生菌的技術(shù)門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產(chǎn)上和使用時間對不上號。像一些常規(guī)益生菌完全可以用自己擴(kuò)培，比如乳酸菌，光合菌

horsegreenhill

蟹將 發(fā)表于 2016-4-8 10:21
這篇文章可能有一些不妥的地方 ，提提意見

1. 乳酸菌發(fā)酵時間才20h,就來進(jìn)行質(zhì)量評價，不科學(xué)，起碼發(fā)酵 ...

非常感謝您的回復(fù)，有不同聲音、有爭論、有交流才會進(jìn)步。我也對您提出的意見進(jìn)行逐一回復(fù)：

1、其實菌種擴(kuò)培所需要的時間同菌種、培養(yǎng)基及所處的環(huán)境關(guān)系非常大，您說的96小時是不是溫度較低？用的糖蜜等緩釋碳源？如果菌種活力足夠，培養(yǎng)基營養(yǎng)充分，且溫度30攝氏度左右，20小時是可以完成擴(kuò)培的。

2、沒錯，這確實是經(jīng)典的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)大腸桿菌、芽孢桿菌都沒有問題的。其中胰蛋白胨既可以提供氮源，又可以提供碳源。
3、我這里提到的是養(yǎng)殖戶自己擴(kuò)培菌，并不是潑灑葡萄糖，潑灑葡萄糖那確實是非常危險的。擴(kuò)培的過程中，如果用葡萄糖作為碳源，其效率遠(yuǎn)高于糖蜜，這也說明了為什么我之前20小時左右就能發(fā)酵好，但一定要把握好擴(kuò)培火候與雜菌控制。

4、這點我非常贊同，以乳酸菌為主的EM還是比較靠譜的，不然擴(kuò)培染菌風(fēng)險較高。

5、文章中所提為：通過顯微鏡的觀察能夠區(qū)分球菌、桿菌、鏈球菌，及大概判斷下菌數(shù)目多少，酵母菌大概比常見細(xì)菌大10倍左右，400倍放大觀察這些內(nèi)容是沒有問題的。但觀察細(xì)菌需要用結(jié)晶紫進(jìn)行染色，如果想了解這方面的知識，咱們可以詳聊。下面我附幾張400倍放大的芽孢桿菌、乳酸菌圖片。對于咱們養(yǎng)殖戶，通過pH來判斷發(fā)酵是否成功確實是個好辦法，顯微鏡的觀察可能需要比較專業(yè)的培訓(xùn)。

下圖是巨大芽孢桿菌，透明小體為芽孢（10*40，結(jié)晶紫染色）

下圖是乳酸鏈球菌，能夠觀察到呈鏈狀的球形菌（10*40，結(jié)晶紫染色）

再次感謝您的回復(fù)，希望咱們能夠多多交流，共同進(jìn)步！

horsegreenhill

jinlimin1 發(fā)表于 2016-4-8 09:15
請教400倍顯微鏡怎么看乳酸菌、芽孢桿菌等微生物？

需要通過結(jié)晶紫染色即可觀察，可查看下面回復(fù)，有相關(guān)照片。

蟹將

vanadis 發(fā)表于 2016-4-8 14:09
自己擴(kuò)培益生菌的技術(shù)門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產(chǎn)上和使用時間對不上號。像一些常規(guī)益生菌完 ...

是的，如果能趕上擴(kuò)培和使用周期 相當(dāng)經(jīng)濟(jì)，大型養(yǎng)殖場可以嘗試

蟹將

vanadis 發(fā)表于 2016-4-8 14:09
自己擴(kuò)培益生菌的技術(shù)門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產(chǎn)上和使用時間對不上號。像一些常規(guī)益生菌完 ...

的確是這樣 如果能現(xiàn)培現(xiàn)用 那是極好的

horsegreenhill

jinlimin1 發(fā)表于 2016-4-8 09:15
請教400倍顯微鏡怎么看乳酸菌、芽孢桿菌等微生物？

需要通過結(jié)晶紫染色即可觀察，可查看下面回復(fù)，有相關(guān)照片。

horsegreenhill

蟹將 發(fā)表于 2016-4-8 10:03
的確是博士級別的 但是這個培養(yǎng)配方不適合養(yǎng)殖戶，而且自己培養(yǎng)EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌數(shù)量級達(dá)到十億 ...

您剛才也提到了，現(xiàn)在的EM以乳酸菌為主，這樣擴(kuò)培出來的乳酸菌倒是也不錯！

horsegreenhill

蟹將 發(fā)表于 2016-4-8 10:03
的確是博士級別的 但是這個培養(yǎng)配方不適合養(yǎng)殖戶，而且自己培養(yǎng)EM菌 pH 可以低到3.2-3.5，菌數(shù)量級達(dá)到十億 ...

您剛才也提到了，現(xiàn)在的EM以乳酸菌為主，這樣擴(kuò)培出來的乳酸菌倒是也不錯！

horsegreenhill

vanadis 發(fā)表于 2016-4-8 14:09
自己擴(kuò)培益生菌的技術(shù)門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產(chǎn)上和使用時間對不上號。像一些常規(guī)益生菌完 ...

沒錯，推薦自己擴(kuò)培，經(jīng)濟(jì)、節(jié)約成本，這是最大的好處。而且擴(kuò)培的活菌效果還能更好一些。多多交流！

蟹將

vanadis 發(fā)表于 2016-4-8 14:09
自己擴(kuò)培益生菌的技術(shù)門檻并不是太高，就是就點麻煩，其次 是生產(chǎn)上和使用時間對不上號。像一些常規(guī)益生菌完 ...

的確是這樣 如果能現(xiàn)培現(xiàn)用 那是極好的

漁歌子

@東興展豐盧善明：1、如果菌種在擴(kuò)培中都長不成優(yōu)勢，都無法抑制有害菌，只能說明該公司的菌種不行。2、擴(kuò)培的菌好不好取決于菌種，國家標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)上允許雜菌的存在。

horsegreenhill

蟹將 發(fā)表于 2016-4-8 14:20
的確是這樣 如果能現(xiàn)培現(xiàn)用 那是極好的

在養(yǎng)殖塘口弄個簡易發(fā)酵罐，怎么樣？現(xiàn)用現(xiàn)取

horsegreenhill

漁歌子 發(fā)表于 2016-4-8 14:31
@東興展豐盧善明：1、如果菌種在擴(kuò)培中都長不成優(yōu)勢，都無法抑制有害菌，只能說明該公司的菌種不行。2、擴(kuò)培 ...

沒錯，希望良心公司生產(chǎn)良心菌種，讓老百姓都能擴(kuò)培出優(yōu)質(zhì)、高效的益生菌！
菌種只是一方面，另外，培養(yǎng)基好不好？擴(kuò)培方式對不對？擴(kuò)培條件合適不合適？都非常重要。