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標(biāo)題: 石斑魚的病毒性疾病 [打印本頁]

作者: 養(yǎng)魚魚養(yǎng) 時(shí)間: 2013-1-6 00:34
標(biāo)題: 石斑魚的病毒性疾病
石斑魚的病毒性疾病

在臺(tái)灣，石斑魚是常見的桌上佳餚，也是節(jié)慶宴客中的高級(jí)食材。在外銷方面，中國、香港的石斑魚市場一直都供不應(yīng)求。農(nóng)委會(huì)表示，自民國98年起推動(dòng)石斑魚產(chǎn)值倍增計(jì)畫以來，臺(tái)灣不僅產(chǎn)值已居世界第一、產(chǎn)量也居第二，且海峽兩岸經(jīng)濟(jì)合作架構(gòu)協(xié)議（ECFA）簽訂後，民國102年的石斑魚產(chǎn)值可望達(dá)到新臺(tái)幣76億元的目標(biāo)。
雖然石斑魚苗孵化率可高達(dá)80～90％，但受到病毒感染、環(huán)境不良的影響，魚苗育成率可能低於1％，造成養(yǎng)殖成本攀升。疾病問題若不解決，石斑魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展便會(huì)受到限制。
臺(tái)灣的石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)分工細(xì)密，餌料生物也都有專門的養(yǎng)殖場，只是因土地狹小，養(yǎng)殖區(qū)又密集，放養(yǎng)密度過高，上、下游養(yǎng)殖戶水道連通，且進(jìn)、排水設(shè)計(jì)不良，疾病容易傳播。因此，要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)價(jià)值高且品系優(yōu)良的石斑魚，就得發(fā)展有效的檢測和防治疾病技術(shù)。
感染途徑
目前石斑魚最主要的病毒感染性疾病，有神經(jīng)壞死病毒與石斑魚虹彩病毒兩種。石斑魚苗從孵化開始至40天內(nèi)，容易被神經(jīng)壞死病毒感染，使得神經(jīng)系統(tǒng)遭到破壞，死亡率高達(dá)90％。而從吋魚生長至成魚時(shí)，容易受到虹彩病毒感染，造成組織器官病變，死亡率約60％。受到病毒感染而未死亡的魚隻會(huì)成為帶原者，持續(xù)傳播病毒。
神經(jīng)壞死病毒有垂直感染與水平感染兩種途徑，病毒可由親魚的體液直接傳遞給受精卵，造成仔魚一孵化就帶有病原，並感染同池魚隻。發(fā)病時(shí)，魚苗體色變黑，且因無法平衡造成泳動(dòng)時(shí)不正常的旋轉(zhuǎn)，最後腦部與視網(wǎng)膜產(chǎn)生空洞，使細(xì)胞壞死而死亡。
虹彩病毒的主要傳播途徑是水平感染，感染初期沒有明顯特徵，每天僅死亡數(shù)條，但死亡率會(huì)漸漸增加。水質(zhì)不佳時(shí)，幼魚感染率可達(dá)100％，且可能成為帶原魚而感染同池魚隻。嚴(yán)重時(shí)，體色也會(huì)變黑，脾臟和前腎會(huì)明顯腫大，後腎微微腫大，腹部偶爾可見出血點(diǎn)，鰓部充血或出血，鰓絲血管的結(jié)構(gòu)凌亂且充滿肥大細(xì)胞，可能導(dǎo)致鰓部氣體交換受阻。
檢測方法
由於水體傳播魚類病毒感染的速度快，只要有1條魚染病，整池就難以倖免。快速且準(zhǔn)確地檢測出疾病，可以初步控制疾病的散播，而越早偵測出病毒，就越容易減少整池魚發(fā)病帶來的損失。因此，開發(fā)簡便快速、靈敏度高、專一性強(qiáng)的檢測方法非常重要。目前魚類病毒性疾病的檢測，主要是使用分子生物學(xué)檢測技術(shù)和免疫檢測技術(shù)，來鑑別病毒特殊的遺傳物質(zhì)或蛋白質(zhì)。
分子生物學(xué)檢測技術(shù)是藉由核酸鹼基配對(duì)的特異性，偵測特定DNA片段的技術(shù)。首先篩選具有特異性的DNA片段做為探針，並標(biāo)記放射線、螢光或酵素呈色等可判讀的物質(zhì)，再與病原DNA雜合反應(yīng)後，若在已知分子量大小處顯影或呈色，就可以判斷其病原種類。以下分別簡述4種方法的檢測原理。
利用1983年穆里斯（Kary B. Mullis）發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，使用一對(duì)引子把病毒的DNA或RNA反轉(zhuǎn)錄後的cDNA擴(kuò)大表現(xiàn)，便容易檢測出病毒。若選擇合適的循環(huán)數(shù)，配合膠體電泳分析，分離不同片段的大小，就可以得到相對(duì)的定量值。以神經(jīng)壞死病毒為例，偵測極限可以到102 TCID50／ml。（tissue culture infection dosage, TCID）使用第一次聚合酶鏈反應(yīng)的產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二次聚合酶鏈反應(yīng)，可偵測的極限會(huì)更高。
即時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是利用DNA結(jié)合特殊螢光染料，在聚合酶鏈反應(yīng)過程中不斷地嵌入產(chǎn)物內(nèi)，並用電腦在每個(gè)循環(huán)即時(shí)偵測螢光訊號(hào)的強(qiáng)度，以得知聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物累積的程度。分析螢光強(qiáng)度與聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)係，與已知量的標(biāo)準(zhǔn)DNA比較，就可以進(jìn)行定性與定量分析。以神經(jīng)壞死病毒為例，偵測極限可以到101 TCID50／ml。
微流體即時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是即時(shí)定量聚合酶連鎖反應(yīng)技術(shù)的改良，目的是縮小體積使其具可攜帶性。例如由成功大學(xué)陳宗嶽及李國賓二位教授共同研發(fā)的微流體晶片系統(tǒng)，配合生物晶片技術(shù)，把混合反應(yīng)槽、加熱反應(yīng)槽、分離管道與偵測容槽集中在一片微陣列晶片上，可以快速且準(zhǔn)確執(zhí)行溫度的循環(huán)控制，偵測極限最低可至10 copies／μl，反應(yīng)時(shí)間只需2.5個(gè)小時(shí)。
另外，恆溫圈環(huán)形核酸增幅法只需在攝氏60～65度的恆溫狀態(tài)下，便能利用引子與核酸聚合酶快速地增殖目標(biāo)核酸。起始反應(yīng)需要上、下兩對(duì)引子辨認(rèn)模板核酸的6段序列，才能進(jìn)行後續(xù)反應(yīng)。這方法具高專一性且反應(yīng)不需循環(huán)升降溫步驟，反應(yīng)所需時(shí)間較聚合酶鏈反應(yīng)短，且只需水浴槽或乾浴槽就可以操作。此外，肉眼就能判讀，加入螢光染劑則可使靈敏度提高。
免疫檢測技術(shù)則是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來檢測病原。若以病毒的結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)為抗原，可檢測出檢體中是否含有病毒。若以病毒的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)為抗原，則能檢測病毒是否處於複製期。以下分別簡述兩種方法的作用原理。
酵素連結(jié)免疫吸附法是以化學(xué)鍵結(jié)方式把酵素標(biāo)記在抗體或抗原上，利用抗原與抗體之間具有專一性的鍵結(jié)特性，配合酵素連結(jié)的呈色反應(yīng)，依照待測物的顏色深淺，進(jìn)行定量或定性分析。這方法的判讀需要較精密的儀器，花費(fèi)較高，但可以設(shè)計(jì)成類似驗(yàn)孕試紙的方式，利用顯色有無來判讀，操作十分簡便。以神經(jīng)壞死病毒為例，偵測極限在104～105 TCID50／ml。
免疫磁減量技術(shù)是筆者實(shí)驗(yàn)室與臺(tái)灣師範(fàn)大學(xué)楊謝樂教授合作開發(fā)的，磁珠主要成分是Fe3O4，把抗神經(jīng)壞死病毒的抗體標(biāo)記在磁珠上，磁珠的大小約65nm，在試劑中可以很均勻地分布，同時(shí)讓磁珠有一個(gè)電場令其旋轉(zhuǎn)，並測量其旋轉(zhuǎn)的磁當(dāng)量。當(dāng)測試樣本沒有病毒時(shí)，其旋轉(zhuǎn)速度最快。當(dāng)磁珠與病毒結(jié)合後，磁性會(huì)減弱而造成磁減量，把這微弱的磁訊號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭闪繙y的電壓，便能透過磁珠轉(zhuǎn)動(dòng)速度來偵測神經(jīng)壞死病毒量。不同量的病毒接合在磁珠的抗體上，會(huì)造成不同程度的旋轉(zhuǎn)速度減緩。
若已建立神經(jīng)壞死病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線，放入待測物後1個(gè)小時(shí)就可經(jīng)由機(jī)器自動(dòng)判讀結(jié)果。以神經(jīng)壞死病毒為例，最低可以偵測到20TCID50／ml以下的病毒量，且專一性強(qiáng)。
在養(yǎng)殖現(xiàn)場，疾病檢測方法不只要追求快速、靈敏度高、專一性強(qiáng)，還要沒有技術(shù)門檻、方便取得、價(jià)格低，才容易在產(chǎn)業(yè)界推行。
防治方法
針對(duì)特定病原開發(fā)疫苗，是目前防治傳染性疾病的有效方式。依施用方法有注射、浸泡、口服等，依製作方式有弱毒化疫苗、不活化疫苗、次單位疫苗、核酸疫苗等。疫苗注射前須以藥物麻醉，目前多使用自動(dòng)化免疫注射器；浸泡型疫苗對(duì)魚類雖有作用，但魚體容易受緊迫，而且注射與浸泡方式的人力成本較昂貴。
口服型疫苗則直接把疫苗沾附或包埋至餌料中，使用更方便，造成的緊迫小且適用於幼魚，但腸胃道酵素會(huì)破壞抗原，而無法誘發(fā)免疫作用。不過，如果利用微脂體、藻膠或生物膜包裹疫苗，使它不被破壞，則有利於疫苗的順利吸收。
筆者實(shí)驗(yàn)室與中央研究院吳金洌特聘研究員利用核醣核酸干擾技術(shù)發(fā)展抗神經(jīng)壞死病毒的水產(chǎn)疫苗，當(dāng)疫苗順利被魚體吸收後，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生小片段雙股RNA，與蛋白質(zhì)聚合體及RNA分解酵素結(jié)合後，遇到同源性的mRNA就會(huì)把它降解，使它無法轉(zhuǎn)譯出蛋白質(zhì)。以微脂體混合飼料餵食後發(fā)現(xiàn)，能成功地把核醣核酸干擾帶入體內(nèi)，使其在魚體內(nèi)產(chǎn)生抗病毒的效果。
成功大學(xué)楊惠郎教授的研究團(tuán)隊(duì)以包埋轉(zhuǎn)殖能表現(xiàn)神經(jīng)壞死病毒基因的大腸桿菌餵食豐年蝦，再利用食物鏈的方式做為口服疫苗直接餵食石斑稚魚，可以保護(hù)石斑稚魚對(duì)抗神經(jīng)壞死病毒的感染，在田間測試也證實(shí)有效。
中山大學(xué)林全信教授的研究團(tuán)隊(duì)利用大腸桿菌建立重組石斑魚神經(jīng)壞死病毒外鞘蛋白，形成類似病毒顆粒，以肌肉注射方式施打可發(fā)揮保護(hù)效果。
臺(tái)灣海洋大學(xué)周信佑教授的研究團(tuán)隊(duì)和農(nóng)委會(huì)水產(chǎn)試驗(yàn)所海水繁養(yǎng)殖研究中心合作，在免疫母雞上注射石斑魚病毒，由雞蛋中取出蛋黃製作抗病毒IgY，再以多重相乳化包埋，製作抗石斑魚神經(jīng)壞死病毒及抗石斑魚虹彩病毒的IgY蛋粉，具有一定的保護(hù)效果，安全性高且成本低。
家畜衛(wèi)生試驗(yàn)已開發(fā)出石斑魚虹彩病毒的不活化疫苗，使用腹腔注射，適於10公克以上的石斑稚魚。田間試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)於點(diǎn)帶石斑及龍膽石斑都有保護(hù)效果，即將通過國家認(rèn)證成為全臺(tái)第一個(gè)合法上市的疫苗。目前，在政府的支持下，已研製100萬劑量免費(fèi)供養(yǎng)殖戶使用。
相同抗原在不同魚種上，也可能有不同的免疫保護(hù)效果。研發(fā)具廣效的病原覆蓋率以提供周全的保護(hù)，並對(duì)魚體、環(huán)境、人體都具有高安全性且符合成本的水產(chǎn)疫苗，是產(chǎn)業(yè)界與學(xué)術(shù)界一直努力的目標(biāo)。
另外，免疫刺激物如脂多糖、幾丁質(zhì)、天然物萃取或益生菌，可以增強(qiáng)魚體免疫力。例如，在飼料裡添加金針菇萃取物，因其含有多醣體及免疫調(diào)節(jié)蛋白，濃度高時(shí)可強(qiáng)化魚體免疫力，且長時(shí)間餵食並無危害。蕈菇、中草藥、珊瑚等都可以萃取出增強(qiáng)魚體免疫的物質(zhì)。金針菇雖然較便宜，但以目前的萃取技術(shù)，成品價(jià)格還是偏高，難以實(shí)用。而直接在水體中加入益生菌，可以調(diào)節(jié)與刺激水產(chǎn)生物免疫功能，並維持環(huán)境中微生物的平衡，提升成長率、存活率及抗病能力，維護(hù)生物的安全性。
健康管理很重要
但疫苗並非萬靈丹，尤其是神經(jīng)壞死病毒好發(fā)於石斑魚幼苗，魚體在出生後12天內(nèi)免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，而一般疫苗攝入後免疫系統(tǒng)需3周才會(huì)到達(dá)高峰，因此必須配合環(huán)境控制，隨時(shí)監(jiān)控養(yǎng)殖場是否有病原入侵。養(yǎng)殖場要有一套統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)流程，且與水產(chǎn)試驗(yàn)機(jī)關(guān)密切配合，定時(shí)檢測以降低發(fā)病率。
養(yǎng)殖場內(nèi)的器具須定期消毒、滅菌，洗卵是目前防止垂直感染的最佳方式。買進(jìn)魚苗前須先檢測病原量，活體餌料如牡蠣受精卵、輪蟲、豐年蝦、橈腳類等都可能是病毒的帶原者。同時(shí)，必須定期檢測水質(zhì)及魚體是否帶有病毒，畢竟預(yù)防勝於治療。
良好的水質(zhì)環(huán)境可以減少緊迫、降低發(fā)病率，減少養(yǎng)殖密度則可以降低魚體互相碰撞的機(jī)率。定期篩選魚隻、大小分缸避免殘食，每一區(qū)塊有物理隔離，才符合生物的安全性。此外，水循環(huán)系統(tǒng)不能共用，以避免病原的流通，且?guī)в胁≡乃豢呻S意排放，避免病原流出。
病毒的存在不是短時(shí)間造成的，臺(tái)灣早就是疫區(qū)，因此最重要的是預(yù)防疾病的爆發(fā)。只要有良好的管理，魚苗能成長至銷售體型，石斑魚產(chǎn)業(yè)仍然值得投資。
控制進(jìn)水與排水系統(tǒng)、隔離病原，都需要水利工程設(shè)計(jì)�；铘~運(yùn)輸?shù)墓ぞ咭残杼厥庠O(shè)計(jì)，以增加溶氧。產(chǎn)業(yè)廢棄物如魚皮與魚骨的加工利用，可帶來附加價(jià)值。因此，養(yǎng)殖業(yè)需要有更多不同領(lǐng)域的人才投入，並與其他產(chǎn)業(yè)連結(jié)以增加產(chǎn)值。此外，減低養(yǎng)殖密度，劃分土地及水資源，使產(chǎn)業(yè)精緻化，養(yǎng)成高產(chǎn)值的石斑魚，並且充分利用資源與維持生態(tài)環(huán)境平衡，才能使養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)永續(xù)發(fā)展。

作者: 星鯊魚油 時(shí)間: 2013-1-8 09:10
學(xué)習(xí)一下，不錯(cuò)

作者: Walking_In_The_ 時(shí)間: 2013-7-28 19:36
龍膽和珍珠龍膽區(qū)別

作者: 雨滴 時(shí)間: 2013-9-12 19:36
是的。我那邊養(yǎng)石斑魚的挺多的。但是目前虹彩病毒和神經(jīng)性壞死病毒比較麻煩。

作者: jason_chong 時(shí)間: 2014-1-13 08:28
哇！好奇特！

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